包括的なプロテオミクスにより、無症候性および症候性アルツハイマー病における脳ベースの脳脊髄液バイオマーカーが明らかに

アルツハイマー病（AD）には、その根底にある複数の病態生理学を反映するタンパク質バイオマーカーが欠如しており、診断と治療の進歩を妨げています。ここでは、包括的なプロテオミクスを使用して、広範なアルツハイマー病の病態生理学を表す脳脊髄液 (CSF) バイオマーカーを特定します。マルチプレックス質量分析により、AD CSF と脳でそれぞれ約 3,500 個と約 12,000 個のタンパク質が同定されました。脳プロテオームのネットワーク解析により、44 個の生物多様性モジュールが解決され、そのうち 15 個は脳脊髄液プロテオームと重複していました。これらの重複モジュール内の CSF AD マーカーは、異なる病態生理学的プロセスを表す 5 つのタンパク質グループに折りたたまれます。アルツハイマー病の脳のシナプスと代謝産物は減少しますが、CSFは増加し、その一方で脳とCSFのグリアに富む髄鞘形成と免疫グループが増加します。パネル変化の一貫性と疾患特異性は、500 を超える追加の CSF サンプルで確認されました。これらのグループは、無症候性アルツハイマー病における生物学的サブグループも特定しました。全体として、これらの結果は、アルツハイマー病の臨床応用のためのウェブベースのバイオマーカー ツールに向けた有望な一歩となります。
アルツハイマー病 (AD) は、世界中で神経変性認知症の最も一般的な原因であり、シナプス伝達、グリア媒介免疫、ミトコンドリア代謝などの幅広い生物学的システムの機能不全を特徴としています (1-3)。しかし、その確立されたタンパク質バイオマーカーは依然としてアミロイドおよびタウタンパク質の検出に重点を置いており、したがってこの多様な病態生理学を反映することができません。脳脊髄液 (CSF) 中で最も確実に測定されるこれらの「コア」タンパク質バイオマーカーには、(i) 皮質アミロイド斑の形成を反映するアミロイド ベータ ペプチド 1-42 (Aβ1-42)、(i) アミロイド ベータ ペプチド 1-42 (Aβ1-42)、および(ii) 総タウ、軸索変性の兆候。 (iii) リン酸化タウ (p-タウ)、病理学的タウ過剰リン酸化の代表例 (4-7)。これらの脳脊髄液バイオマーカーは、「顕著な」AD タンパク質疾患の検出を大幅に容易にしましたが (4-7)、それらは疾患の背後にある複雑な生物学のほんの一部を表しているにすぎません。
AD バイオマーカーの病態生理学的多様性の欠如は、(i) AD 患者の生物学的不均一性を特定および定量化できないこと、(ii) 特に前臨床段階における疾患の重症度および進行の不十分な測定など、多くの課題を引き起こしています。 iii) 神経学的悪化のあらゆる側面を完全には解決できなかった治療薬の開発。関連疾患によるアルツハイマー病を説明するために画期的な病理学に依存していることは、これらの問題を悪化させるだけです。認知症の高齢者のほとんどが認知機能低下の複数の病理学的特徴を持っていることを示す証拠が増えています(8)。 AD 病理を患う人の 90% 以上が、血管疾患、TDP-43 封入体、またはその他の変性疾患も患っています (9)。このような病理学的重複の割合が高いため、認知症の現在の診断枠組みが混乱しており、この疾患のより包括的な病態生理学的定義が必要です。
さまざまなアルツハイマー病バイオマーカーの緊急の必要性を考慮して、この分野では、バイオマーカーを発見するためのシステム全体に基づく「オミクス」手法の採用が増えています。 Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance は 2014 年に発足し、プログラムの最前線に立っています。国立衛生研究所、学界、産業界によるこの学際的な取り組みは、システムベースの戦略を使用してアルツハイマー病の病態生理学をより適切に定義し、生物多様性の診断分析と治療戦略を開発することを目的としています(10)。このプロジェクトの一環として、ネットワーク プロテオミクスは、アルツハイマー病におけるシステムベースのバイオマーカーの進歩のための有望なツールとなっています。この公平なデータ駆動型アプローチは、複雑なプロテオミクス データセットを、特定の細胞型、細胞小器官、および生物学的機能に関連する共発現タンパク質のグループまたは「モジュール」に編成します (11-13)。アルツハイマー病の脳に関しては、ほぼ 12 件の情報豊富なネットワーク プロテオミクス研究が実施されています (13-23)。全体として、これらの分析は、AD 脳ネットワーク プロテオームが独立したコホートおよび複数の皮質領域で高度に保存されたモジュール構成を維持していることを示しています。さらに、これらのモジュールの一部は、複数の疾患の病態生理学を反映する、データセット全体にわたる AD 関連の存在量の再現可能な変化を示します。まとめると、これらの発見は、AD におけるシステムベースのバイオマーカーとしての脳ネットワーク プロテオームの発見にとって有望なアンカー ポイントであることを示しています。
AD 脳ネットワーク プロテオームを臨床的に有用なシステムベースのバイオマーカーに変換するために、脳由来のネットワークと AD CSF のプロテオーム解析を組み合わせました。この統合的なアプローチにより、シナプス、血管、髄鞘形成、炎症、代謝経路の機能不全など、幅広い脳ベースの病態生理学に関連する 5 つの有望な CSF バイオマーカー セットが同定されました。私たちは、さまざまな神経変性疾患からの 500 以上の CSF サンプルを含む複数の複製分析を通じて、これらのバイオマーカー パネルの検証に成功しました。これらの検証分析には、無症候性 AD (AsymAD) 患者の CSF におけるグループ標的の検査や、正常な認知環境における異常なアミロイド蓄積の証拠を示すことが含まれます。これらの分析は、AsymAD 集団における重大な生物学的不均一性を強調し、疾患の初期段階で個人をサブタイプ化できる可能性のあるパネル マーカーを特定します。全体として、これらの結果は、AD が直面する臨床課題の多くを首尾よく解決できる複数のシステムに基づくタンパク質バイオマーカー ツールの開発における重要なステップを表しています。
この研究の主な目的は、アルツハイマー病を引き起こすさまざまな脳ベースの病態生理学を反映する新しい脳脊髄液バイオマーカーを同定することです。図 S1 は、我々の研究手法の概要を示しています。これには、(i) 複数の脳関連 CSF 疾患バイオマーカーを同定するための AD CSF およびネットワーク脳プロテオームの予備的発見に基づく包括的な分析、および (ii) その後の複製が含まれます。これらのバイオマーカーは、いくつかの独立した脳脊髄に存在します。流動的なコホート。この発見指向の研究は、エモリー・ゴイズエタ・アルツハイマー病研究センター（ADRC）の20人の認知的に正常な個人と20人のアルツハイマー病患者におけるCSFの差次的発現の分析から始まった。 AD の診断は、脳脊髄液中の Aβ1-42 が低く、総タウおよび p-タウのレベルが上昇している場合の重大な認知障害として定義されます [平均モントリオール認知評価 (MoCA)、13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (表 S1A)。対照（平均ＭｏＣＡ、２６．７±２．２）は、正常レベルのＣＳＦバイオマーカーを有していた。
ヒト CSF は、タンパク質存在量のダイナミックレンジによって特徴付けられ、アルブミンやその他の非常に豊富なタンパク質により、目的のタンパク質の検出が妨げられる可能性があります (24)。タンパク質の発見をさらに深くするために、質量分析 (MS) 分析の前に、各 CSF サンプルから最初の 14 個の非常に豊富なタンパク質を除去しました (24)。合計 39,805 個のペプチドが MS によって同定され、40 サンプル中の 3691 個のプロテオームにマッピングされました。タンパク質の定量は、複数のタンデム質量タグ (TMT) 標識によって実行されます (18、25)。欠損データを解決するために、その後の分析ではサンプルの少なくとも 50% で定量されたタンパク質のみを含め、最終的に 2875 個のプロテオームを定量しました。総タンパク質存在量レベルに有意な差があるため、対照サンプルは統計的に外れ値とみなされ (13)、その後の分析には含まれませんでした。残りの 39 サンプルの存在量値は、年齢、性別、バッチ共分散 (13-15、17、18、20、26) に従って調整されました。
統計的 t 検定分析を使用して回帰データセットの差次的発現を評価することにより、この分析により、コントロールと AD 症例の間で存在量レベルが有意に変化した (P <0.05) タンパク質が特定されました (表 S2A)。図 1A に示すように、AD では合計 225 個のタンパク質の存在量が大幅に減少し、303 個のタンパク質の存在量が大幅に増加しました。これらの差次的に発現されるタンパク質には、微小管関連タンパク質タウ (MAPT; P = 3.52 × 10−8)、神経フィラメント (NEFL; P = 6.56 × 10−3)、成長関連タンパク質 43 など、以前に同定されたいくつかの脳脊髄液 AD マーカーが含まれます。 (GAP43; P = 1.46 × 10−5)、脂肪酸結合タンパク質 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5)、キチナーゼ 3 様 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6)、神経グラニュリン (NRGN; P = 2.00 × 10−5) P = 3.43 × 10−4) および VGF 神経成長因子 (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6)。ただし、GDP 解離阻害剤 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) や SPARC 関連モジュラー カルシウム結合 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) など、他の非常に重要なターゲットも特定しました。 225 個の大幅に減少したタンパク質のジーンオントロジー (GO) 分析により、ステロイド代謝、血液凝固、ホルモン活性などの体液プロセスとの密接な関係が明らかになりました (図 1B および表 S2B)。対照的に、303 のタンパク質の大幅な増加は、細胞構造とエネルギー代謝に密接に関係しています。
(A) ボルケーノ プロットは、t 検定によって得られた -log10 統計 P 値 (y 軸) に対する log2 倍率変化 (x 軸) を示します。これは、コントロール (CT) とコントロール (CT) との間の発現差を検出するために使用されます。 CSF プロテオームの AD 症例 すべてのタンパク質。 AD においてレベルが有意に低下したタンパク質 (P <0.05) は青で示され、疾患においてレベルが有意に増加したタンパク質は赤で示されます。選択したタンパク質は標識されます。 (B) タンパク質に関連する上位の GO 用語は、AD において大幅に減少 (青) し、増加 (赤) します。生物学的プロセス、分子機能、細胞成分の分野で最も高い Z スコアを持つ 3 つの GO 用語を表示します。 (C) MS により測定された CSF サンプル中の MAPT レベル (左) およびサンプルの ELISA タウ レベルとの相関 (右)。関連する P 値を伴うピアソン相関係数が表示されます。 1 件の AD 症例の ELISA データが不足しているため、これらの数値には、分析された 39 件のうち 38 件の値が含まれています。 (D) データセット内の最も大きく変化した 65 個のタンパク質を使用した、コントロールおよび AD CSF 検出サンプルに対する教師ありクラスター分析 (P <0.0001、Benjamini-Hochberg (BH) 調整 P <0.01)。標準化、正規化。
MAPT のプロテオーム レベルは、独立して測定された ELISA タウ レベル (r = 0.78、P = 7.8 × 10-9; 図 1C) と密接に関連しており、MS 測定の妥当性が裏付けられています。アミロイド前駆体タンパク質 (APP) レベルでのトリプシン消化後、Aβ1-40 および Aβ1-42 の C 末端にマッピングされたアイソフォーム特異的ペプチドは効率的にイオン化できません (27、28)。したがって、我々が同定した APP ペプチドは ELISA Aβ1-42 レベルとは何の関係もありません。各ケースの差次的発現を評価するために、P <0.0001 [偽発見率 (FDR) 補正 P <0.01] の差次的発現タンパク質を使用して、サンプルの教師ありクラスター分析を実行しました (表 S2A)。図 1D に示すように、これらの 65 の非常に重要なタンパク質は、対照のような特徴を持つ 1 つの AD 症例を除いて、疾患状態に従ってサンプルを正確にクラスター化できます。これら 65 個のタンパク質のうち、63 個が AD で増加しましたが、減少したのは 2 個 (CD74 と ISLR) だけでした。合計すると、これらの脳脊髄液分析により、疾患バイオマーカーとして機能する可能性のあるアルツハイマー病のタンパク質が数百個同定されました。
次に、AD 脳プロテオームの独立したネットワーク分析を実行しました。この発見の脳コホートには、対照（n = 10）、パーキンソン病（PD; n = 10）、AD/PD混合（n = 10）およびAD（n = 10）の背外側前頭前野（DLPFC）症例が含まれていました。 ）サンプル。エメリー・ゴイズエタADRC。これら 40 件の症例の人口統計は以前に記載されており (25)、表 S1B にまとめられています。私たちはTMT-MSを使用して、これら40の脳組織と27症例の複製コホートを分析しました。合計すると、これら 2 つの脳データ セットから 227,121 個の固有のペプチドが生成され、それらは 12,943 個のプロテオームにマッピングされました (25)。症例の少なくとも 50% で定量化されたタンパク質のみが、その後の調査に含まれました。最終的な発見データセットには、8817 個の定量化されたタンパク質が含まれています。年齢、性別、死後間隔 (PMI) に基づいてタンパク質の存在量レベルを調整します。回帰後のデータセットの差次的発現分析により、2 つ以上の疾患コホートで >2000 タンパク質レベルが有意に変化したことが示されました [P <0.05、分散分析 (ANOVA)]。次に、差次的に発現したタンパク質に基づいて教師付きクラスター分析を実行し、AD/対照および/またはAD/PD比較で P <0.0001でした（図S2、AおよびB、表S2C）。これら 165 個の高度に変化したタンパク質は、対照サンプルと PD サンプルからの AD 病理の症例を明確に示しており、プロテオーム全体における強力な AD 特異的変化が確認されています。
次に、重み付け遺伝子共発現ネットワーク解析 (WGCNA) と呼ばれるアルゴリズムを使用して、発見された脳プロテオームに対してネットワーク解析を実行しました。これにより、データセットが同様の発現パターンを持つタンパク質モジュールに編成されます (11-13)。分析により、44 個のモジュール (M) の共発現タンパク質が特定され、最大 (M1、n = 1821 タンパク質) から最小 (M44、n = 34 タンパク質) まで分類され、番号が付けられました (図 2A および表 S2D))。前述したように、（１３）各モジュールの代表的な発現プロファイルまたは特徴的なタンパク質を計算し、それを病態およびＡＤ病態と相関付ける、すなわち、アルツハイマー病レジストリ（ＣＥＲＡＤ）とブラークスコアとの連携を確立する（図２Ｂ）。全体として、17 のモジュールが AD 神経病理学に有意に関連していました (P <0.05)。これらの疾患関連モジュールの多くには、細胞型特異的マーカーも豊富に含まれています (図 2B)。上記 (13) で述べたように、細胞型の濃縮は、モジュールの重複と細胞型特異的遺伝子の参照リストを分析することによって決定されます。これらの遺伝子は、単離されたマウスのニューロン、内皮細胞、グリア細胞の公表データに基づいています。 RNA シーケンス (RNA-seq) 実験 (29)。
(A) 脳プロテオームの WGCNA を発見します。 (B) CERAD (Aβ プラーク) および Braak (タウもつれ) スコアを含む、AD 神経病理学的特徴 (上) とモジュラー シグネチャー タンパク質 (モジュラー タンパク質発現の最初の主要成分) の二重重み中間相関 (BiCor) 分析。正（赤）と負（青）の相関の強度は 2 色のヒート マップで示され、アスタリスクは統計的有意性を示します (P <0.05)。超幾何フィッシャーの直接確率検定 (FET) (下) を使用して、各タンパク質モジュールの細胞型の関連性を評価します。赤い陰影の強度は細胞型の濃縮の程度を示し、アスタリスクは統計的有意性を示します (P <0.05)。 BH 法を使用して、FET から導出される P 値を補正します。 (C) モジュラータンパク質の GO 解析。最も密接に関連する生物学的プロセスが、各モジュールまたは関連するモジュール グループごとに表示されます。オリゴ、希突起膠細胞。
5 つの密接に関連した星状細胞およびミクログリアに富むモジュール (M30、M29、M18、M24、および M5) のセットは、AD 神経病理学と強い正の相関を示しました (図 2B)。オントロジー分析は、これらのグリアモジュールを細胞の成長、増殖、および免疫と関連付けます (図 2C および表 S2E)。さらに 2 つのグリア モジュール、M8 および M22 も疾患において強く上方制御されます。 M8 は、自然免疫応答において重要な役割を果たすシグナル伝達カスケードである、Toll 様受容体経路と高度に関連しています (30)。同時に、M22 は翻訳後修飾と密接に関連しています。希突起膠細胞が豊富な M2 は、アルツハイマー病の病態との強い正の相関関係、およびヌクレオシド合成および DNA 複製との存在論的関連を示し、疾患における細胞増殖の亢進を示しています。全体として、これらの発見は、AD ネットワーク プロテオームで以前に観察されたグリア モジュールの上昇を裏付けています (13、17)。現在、ネットワーク内の多くの AD 関連グリア モジュールは、対照症例と PD 症例でより低い発現レベルを示し、AD で上昇する疾患特異性を強調していることが判明しています (図 S2C)。
ネットワーク プロテオームの 4 つのモジュール (M1、M3、M10、および M32) のみが AD 病理と強い負の相関を示します (P <0.05) (図 2、B および C)。 M1 と M3 は両方とも神経マーカーが豊富です。 M1 はシナプス信号と高度に関連しており、M3 はミトコンドリア機能と密接に関連しています。 M10 および M32 の細胞型が濃縮されたという証拠はありません。 M32 は M3 と細胞代謝との関係を反映しており、M10 は細胞成長と微小管機能に深く関連しています。 AD と比較して、コントロールおよび PD では 4 つのモジュールすべてが増加しており、疾患特異的な AD 変化が生じています (図 S2C)。全体として、これらの結果は、AD で以前に観察されたニューロン豊富なモジュールの量の減少を裏付けています (13、17)。要約すると、我々が発見した脳プロテオームのネットワーク分析は、我々の以前の発見と一致して、AD特異的に変化したモジュールを生成した。
AD は初期の無症候性段階 (AsymAD) を特徴とし、この段階では臨床的認知機能の低下を伴わずにアミロイドの蓄積が見られます (5, 31)。この無症候性の段階は、早期発見と介入にとって重要な時期となります。我々は以前、独立したデータセット全体にわたって AsymAD および AD 脳ネットワーク プロテオームの強力なモジュール保存を実証しました (13、17)。私たちが現在発見している脳ネットワークがこれらの以前の発見と一致していることを確認するために、27 の DLPFC 組織から複製されたデータセット内の 44 のモジュールの保存を分析しました。これらの組織には、コントロール (n = 10)、AsymAD (n = 8)、および AD (n = 9) の症例が含まれます。対照およびアルツハイマー病のサンプルは、発見脳コホートの分析に含まれていましたが（表S1B）、AsymADの症例は複製コホート内でのみ特有でした。これらの AsymAD 症例は、エモリー ゴイズエタ ADRC ブレイン バンクからもたらされました。死亡時の認知機能は正常であったが、アミロイドレベルは異常に高かった（平均CERAD、2.8±0.5）（表S1B）。
これら 27 の脳組織の TMT-MS 分析により、11,244 個のプロテオームが定量化されました。この最終的なカウントには、サンプルの少なくとも 50% で定量されたタンパク質のみが含まれます。この複製されたデータセットには、発見脳分析で検出された 8,817 個のタンパク質のうち 8,638 個 (98.0%) が含まれており、対照コホートと AD コホートの間で 3,000 個近くの有意に変化したタンパク質が含まれています (P <0.05、分散分析のための Tukey の対応のある t 検定後) (表S2F）。これらの差次的に発現されたタンパク質のうち、910 もまた、AD 症例と脳プロテオーム対照症例との間で有意なレベル変化を示した (ANOVA Tukey 対応 t 検定後、P <0.05)。これら 910 個のマーカーは、プロテオーム間の変化の方向において非常に一貫性があることは注目に値します (r = 0.94、P <1.0 × 10-200) (図 S3A)。増加したタンパク質の中で、データセット間で最も一貫した変化を示すタンパク質は、主にグリアに富む M5 および M18 モジュール (MDK、COL25A1、MAPT、NTN1、SMOC1、および GFAP) のメンバーです。減少したタンパク質の中で、最も一貫した変化を示したタンパク質は、ほぼもっぱらシナプスに関連する M1 モジュール (NPTX2、VGF、および RPH3A) のメンバーでした。さらに、ミッドカイン (MDK)、CD44、分泌フリズルド関連タンパク質 1 (SFRP1)、および VGF の AD 関連変化をウェスタンブロッティングによって検証しました (図 S3B)。モジュール保存分析により、脳プロテオーム内のタンパク質モジュールの約 80% (34/44) が複製データセットで有意に保存されていることが示されました (z スコア > 1.96、FDR 補正 P < 0.05) (図 S3C)。これらのモジュールのうち 14 個は 2 つのプロテオーム間で特別に確保されました (z スコア > 10、FDR 補正 P <1.0 × 10−23)。全体として、脳プロテオーム間の差次的発現およびモジュール構成における高度な一貫性の発見と再現は、AD 前頭皮質タンパク質の変化の再現性を強調しています。さらに、AsymAD とより進行した疾患が非常に類似した脳ネットワーク構造を持っていることも確認されました。
脳複製データセットにおける差次的発現のより詳細な分析は、AsymAD とコントロールの間で合計 151 個の有意に変化したタンパク質を含む、AsymAD タンパク質の有意な程度の変化を強調します (P <0.05) (図 S3D)。アミロイド負荷と一致して、AsymAD および AD の脳内の APP は大幅に増加しました。 MAPT は AD でのみ大きく変化しますが、これはもつれレベルの増加および認知機能低下との既知の相関関係と一致しています (5、7)。グリアに富むモジュール (M5 および M18) は AsymAD におけるタンパク質の増加に強く反映されていますが、ニューロン関連 M1 モジュールは AsymAD におけるタンパク質の減少の最も代表的なものです。これらの AsymAD マーカーの多くは、症候性疾患において大きな変化を示します。これらのマーカーの中には、M18 に属するグリアタンパク質である SMOC1 があり、脳腫瘍や目や手足の発達に関連しています (32)。 MDK は、細胞増殖と血管新生に関連するヘパリン結合増殖因子 (33) であり、M18 のもう 1 つのメンバーです。対照群と比較して、AsymAD が有意に増加し、続いて AD がさらに増加し​​ました。対照的に、シナプスタンパク質ニューロペントラキシン 2 (NPTX2) は、AsymAD 脳では大幅に減少しました。 NPTX2 は以前に神経変性と関連しており、興奮性シナプスの媒介における役割が認められています (34)。全体として、これらの結果は、アルツハイマー病におけるさまざまな前臨床タンパク質の変化が、疾患の重症度に応じて進行すると思われることを明らかにしています。
脳プロテオームの発見においてタンパク質の網羅範囲をかなり深く達成したことを考慮して、ネットワークレベルのADトランスクリプトームとの重複をより完全に理解しようとしています。したがって、我々は発見した脳プロテオームを、AD (n = 308) および対照 (n = 157) の DLPFC 組織における 18,204 個の遺伝子のマイクロアレイ測定から以前に生成したモジュールと比較しました (13)。重複。合計で 20 の異なる RNA モジュールが同定され、その多くはニューロン、希突起膠細胞、星状膠細胞、ミクログリアなどの特定の細胞タイプの濃縮を示しました (図 3A)。 AD におけるこれらのモジュールの複数の変更を図 3B に示します。より深い非標識 MS プロテオーム (約 3000 タンパク質) を使用した以前のタンパク質-RNA オーバーラップ分析 (13) と一致して、我々が発見した脳プロテオーム ネットワーク内の 44 モジュールのほとんどはトランスクリプトーム ネットワーク内にあり、顕著な重複はありません。脳プロテオームに高度に保持されている 34 個のタンパク質モジュールを発見して複製したところ、フィッシャーの直接確率検定 (FET) に合格したのは 14 個 (約 40%) のみで、トランスクリプトームと統計的に有意な重複があることが判明しました (図 3A)。 DNA 損傷修復 (P-M25 および P-M19)、タンパク質翻訳 (P-M7 および P-M20)、RNA 結合/スプライシング (P-M16 および P-M21)、タンパク質ターゲティング (P-M13 および P-M13) と互換性があります。 M23) はトランスクリプトーム内のモジュールと重複しません。したがって、現在のオーバーラップ解析ではより深いプロテオーム データセットが使用されていますが (13)、AD ネットワーク プロテオームの大部分はトランスクリプトーム ネットワークにマッピングされていません。
(A) 超幾何 FET は、AD トランスクリプトームの RNA モジュール (上) における細胞型特異的マーカーの濃縮と、AD 脳の RNA (x 軸) モジュールとタンパク質 (y 軸) モジュール間の重複の程度を示します。 （底） 。赤い陰影の強度は、上部パネルの細胞タイプの濃縮の程度、下部パネルのモジュールの重なりの強度を示します。アスタリスクは統計的有意性を示します (P <0.05)。 (B) 各トランスクリプトームモジュールの特徴的な遺伝子と AD 状態との相関の程度。左側のモジュールは AD (青) と最も負の相関があり、右側のモジュールは AD (赤) と最も正の相関があります。対数変換された BH 補正 P 値は、各相関関係の統計的有意性の程度を示します。 (C) 共有細胞タイプの強化を伴う重要な重複モジュール。 (D) 重複モジュール内の標識タンパク質 (x 軸) と RNA (y 軸) の log2 倍率変化の相関分析。関連する P 値を伴うピアソン相関係数が表示されます。ミクロ、ミクログリア。天体、アストロサイト。 CT、コントロール。
重複するタンパク質および RNA モジュールのほとんどは、同様の細胞型濃縮プロファイルと一貫した AD 変化方向を共有しています (図 3、B および C)。言い換えれば、脳プロテオームのシナプス関連M1モジュール（PM1）は、ADに存在する3つのニューロンに富んだ相同RNAモジュール（R-M1、R-M9、R-M16）にマッピングされていることが示されました。レベルが下がった。同様に、グリアに富む M5 および M18 タンパク質モジュールは、アストロ サイトおよびミクログリア マーカー (R-M3、R-M7、および R-M10) に富む RNA モジュールと重複しており、疾患に深く関与しています。 2 つのデータセット間のこれらの共有モジュール機能は、脳プロテオームで観察された細胞型の濃縮と疾患関連の変化をさらに裏付けています。ただし、これらの共有モジュールの個々のマーカーの RNA レベルとタンパク質レベルの間には、多くの大きな違いがあることが観察されました。これらの重複モジュール内の分子のプロテオミクスおよびトランスクリプトミクスの差次的発現の相関分析 (図 3D) は、この矛盾を浮き彫りにします。たとえば、APP および他のいくつかのグリアモジュールタンパク質 (NTN1、MDK、COL25A1、ICAM1、および SFRP1) は、AD プロテオームの大幅な増加を示しましたが、AD トランスクリプトームにはほとんど変化がありませんでした。これらのタンパク質特異的変化はアミロイド斑と密接に関連している可能性があり(23、35)、病理学的変化の原因としてプロテオームが強調されており、これらの変化はトランスクリプトームには反映されていない可能性があります。
私たちが発見した脳とCSFのプロテオームを個別に分析した後、2つのデータセットの包括的な分析を実施して、脳ネットワークの病態生理学に関連するAD CSFバイオマーカーを特定しました。まず、2 つのプロテオームの重複を定義する必要があります。 CSF が AD 脳の神経化学的変化を反映していることは広く受け入れられていますが (4)、AD 脳と CSF プロテオーム間の正確な重複度は不明です。 2 つのプロテオームで検出された共通遺伝子産物の数を比較することにより、脳脊髄液で同定されたタンパク質のほぼ 70% (n = 1936) が脳でも定量化されていることがわかりました (図 4A)。これらの重複タンパク質 (n = 1721) のほとんどは、発見脳データセットの 44 個の共発現モジュールの 1 つにマッピングされています (図 4B)。予想通り、6 つの最大の脳モジュール (M1 ～ M6) が最も多くの CSF の重複を示しました。ただし、サイズが 2 倍の脳モジュールよりも大きい、予想外に高度なオーバーラップを実現する、より小さな脳モジュール (M15 や M29 など) もあります。これにより、脳と脳脊髄液の重複を計算するための、より詳細で統計に基づいた方法を採用する動機が生まれました。
(A および B) Discovery Brain および CSF データセットで検出されたタンパク質は重複しています。これらの重複タンパク質のほとんどは、脳の共発現ネットワークの 44 の共発現モジュールの 1 つに関連しています。 (C) 脳脊髄液プロテオームと脳ネットワーク プロテオームの間の重複を発見します。ヒート マップの各行は、超幾何 FET の個別のオーバーラップ解析を表します。上の行は、脳モジュールと CSF プロテオーム全体の間の重複 (灰色/黒色の陰影) を示しています。 2 行目は、脳モジュールと CSF タンパク質の間の重複 (赤色の陰影) が AD において有意に上方制御されていることを示しています (P <0.05)。 3 行目は、脳モジュールと CSF タンパク質の間の重複 (青色の陰影) が AD において有意に下方制御されていることを示しています (P <0.05)。 BH 法を使用して、FET から導出される P 値を補正します。 (D) 細胞型の関連付けと関連する GO 用語に基づく折りたたみモジュール パネル。これらのパネルには合計 271 個の脳関連タンパク質が含まれており、これらは CSF プロテオームで有意な差次的発現を示します。
シングルテール FET を使用して、CSF プロテオームと個々の脳モジュール間のタンパク質の重複の重要性を評価しました。分析により、CSF データセット内の合計 14 個の脳モジュールに統計的に有意な重複 (FDR 調整 P <0.05) があり、その重複が有意に近い追加モジュール (M18) (FDR 調整 P = 0.06) があることが明らかになりました (図 4C) 、上段）。我々は、差次的に発現されるCSFタンパク質と強く重複するモジュールにも興味を持っています。したがって、我々はさらに 2 つの FET 分析を適用して、(i) AD において CSF タンパク質が有意に増加した、および (ii) CSF タンパク質が AD において有意に減少した（P <0.05、対応のある t 検定 AD/対照）のどちらであるかを決定しました。彼らの間で。図 4C の中段と下の行に示すように、これらの追加の分析は、44 個の脳モジュールのうち 8 個が、AD CSF に追加されたタンパク質 (M12、M1、M2、M18、M5、M44、M33、および M38) と大幅に重複していることを示しています。 。 )、一方、AD CSF の減少したタンパク質との有意な重複を示したのは 2 つのモジュール (M6 および M15) のみでした。予想どおり、10 個のモジュールすべてが、CSF プロテオームとの重複が最も高い 15 個のモジュール内にあります。したがって、これら 15 個のモジュールは AD 脳由来 CSF バイオマーカーの高収量供給源であると考えられます。
これらの 15 個の重複モジュールを、WGCNA 樹形図における近接性と、細胞型および遺伝子オントロジーとの関連に基づいて、5 つの大きなタンパク質パネルに折りたたみました (図 4D)。最初のパネルには、ニューロン マーカーとシナプス関連タンパク質 (M1 および M12) が豊富なモジュールが含まれています。シナプスパネルには合計 94 個のタンパク質が含まれており、CSF プロテオームのレベルは大幅に変化しており、5 つのパネルの中で脳関連 CSF マーカーの最大の供給源となっています。 2 番目のグループ (M6 および M15) は、「創傷治癒」(M6) や「体液性免疫応答の調節」(M15) など、内皮細胞マーカーと血管体との密接な関係を示しました。 M15 はまた、内皮と密接に関連するリポタンパク質代謝にも深く関連しています (36)。血管パネルには、脳に関連する 34 個の CSF マーカーが含まれています。 3 番目のグループには、希突起膠細胞マーカーと細胞増殖に大きく関連するモジュール (M2 および M4) が含まれます。たとえば、M2 のトップレベルのオントロジー用語には、「DNA 複製の正の制御」と「プリン生合成プロセス」が含まれます。一方、M4 には「グリア細胞の分化」と「染色体分離」が含まれます。髄鞘形成パネルには、脳に関連する 49 個の CSF マーカーが含まれています。
4 番目のグループには最も多くのモジュール (M30、M29、M18、M24、および M5) が含まれており、ほぼすべてのモジュールにミクログリアおよび星状細胞マーカーが大幅に豊富に含まれています。髄鞘形成パネルと同様に、4 番目のパネルにも細胞増殖に密接に関連するモジュール (M30、M29、および M18) が含まれています。このグループの他のモジュールは、「免疫効果プロセス」(M5) や「免疫応答制御」(M24) などの免疫学用語に深く関連しています。グリア免疫グループには、脳に関連する 42 個の CSF マーカーが含まれています。最後に、最後のパネルには 4 つのモジュール (M44、M3、M33、および M38) 上の 52 個の脳関連マーカーが含まれており、これらはすべてエネルギー貯蔵と代謝に関連する身体上にあります。これらのモジュールのうち最大のもの (M3) はミトコンドリアと密接に関連しており、ニューロン特異的マーカーが豊富に含まれています。 M38 は、このメタボロームの中で最も小さなモジュール メンバーの 1 つであり、中程度のニューロン特異性も示します。
全体として、これら 5 つのパネルは AD 皮質の幅広い細胞型と機能を反映しており、集合的に 271 個の脳関連 CSF マーカーが含まれています (表 S2G)。これらの MS 結果の妥当性を評価するために、多重化機能、高感度および特異性を備えた直交抗体ベースの技術である近接伸長アッセイ (PEA) を使用し、見つかった脳脊髄液サンプルを再分析しました。 (n = 36)。これらの 36 のターゲットは、PEA の AD 倍数の変化を示しており、これは MS ベースの結果 (r = 0.87、P = 5.6 × 10-12) と密接に関連しており、包括的な MS 分析の結果を強く裏付けています (図 S4)。 ）。
シナプスシグナル伝達からエネルギー代謝に至るまで、私たちの5つのグループが強調する生物学的テーマはすべてADの病因に関連しています(1-3)。したがって、これらのパネルを含む 15 個のモジュールはすべて、我々が発見した脳プロテオームの AD 病理に関連しています (図 2B)。最も注目に値するのは、グリア モジュール間の高い正の病理学的相関と、最大のニューロン モジュール (M1 と M3) 間の強い負の病理学的相関です。複製された脳プロテオームの差次的発現解析 (図 S3D) も、M5 および M18 由来のグリアタンパク質を強調しています。 AsymAD および症候性 AD では、グリアタンパク質が最も増加し、M1 関連シナプスタンパク質が最も減少します。これらの観察は、5 つのグループで特定された 271 の脳脊髄液マーカーが、無症候性の初期段階で発生するものを含む、AD 皮質の疾患プロセスに関連していることを示しています。
脳および脊髄液におけるパネルタンパク質の変化の方向をより適切に分析するために、15 個の重複するモジュールのそれぞれについて次の図を描きました: (i) 脳データセット内のモジュール存在量レベルを見つけ、(ii) モジュールタンパク質の違いは脳脊髄液に現れます（図S5）。前述したように、WGCNA は脳内のモジュール存在量または特徴的なタンパク質の値を決定するために使用されます (13)。火山マップは、脳脊髄液 (AD/コントロール) におけるモジュラータンパク質の差次的発現を記述するために使用されます。これらの図は、5 つのパネルのうち 3 つが脳と脊髄液で異なる発現傾向を示していることを示しています。シナプスパネルの 2 つのモジュール (M1 および M12) は、AD 脳内の存在量レベルの減少を示していますが、AD CSF 内のタンパク質の増加と著しく重複しています (図 S5A)。メタボロームを含むニューロン関連モジュール (M3 および M38) は、一貫性のない同様の脳および脳脊髄液の発現パターンを示しました (図 S5E)。血管パネルも異なる発現傾向を示しましたが、そのモジュール（M6およびM15）はAD脳では中程度に増加し、罹患CSFでは減少しました（図S5B）。残りの 2 つのパネルには、両方のコンパートメントでタンパク質が一貫して上方制御されている大きなグリア ネットワークが含まれています (図 S5、C および D)。
これらの傾向は、これらのパネル内のすべてのマーカーに共通するわけではないことに注意してください。たとえば、シナプスパネルには、AD 脳および CSF で大幅に減少するいくつかのタンパク質が含まれています (図 S5A)。これらの下方制御された脳脊髄液マーカーの中には、M1 の NPTX2 および VGF、および M12 のクロモグラニン B があります。しかし、これらの例外にもかかわらず、ほとんどのシナプスマーカーはアルツハイマー病の脊髄液中で上昇しています。全体として、これらの分析により、5 つのパネルのそれぞれにおける脳および脳脊髄液レベルの統計的に有意な傾向を区別することができました。これらの傾向は、AD における脳と CSF タンパク質発現の間の複雑で、しばしば異なる関係を強調しています。
次に、ハイスループット MS レプリケーション分析 (CSF レプリケーション 1) を使用して、271 セットのバイオマーカーを最も有望で再現性のあるターゲットに絞り込みました (図 5A)。 CSF コピー 1 には、対照、AsymAD、および AD コホートを含む、Emory Goizueta ADRC からの合計 96 サンプルが含まれています (表 S1A)。これらのAD症例は、軽度の認知機能低下（平均MoCA、20.0±3.8）、および脳脊髄液で確認されたADバイオマーカーの変化を特徴としています（表S1A）。私たちが発見したCSF分析とは対照的に、この複製は、個々のサンプルの免疫除去の必要性を排除する簡素化されたサンプル前処理プロトコールを含む、より効率的でハイスループットの「シングルショット」MS法（オフライン分別なし）を使用して実行されます。 。代わりに、免疫が枯渇した単一の「増強チャネル」が、存在量の少ないタンパク質のシグナルを増幅するために使用されます(37)。このシングルショット法ではプロテオームの総カバー率は減少しますが、機械時間が大幅に短縮され、実行可能に分析できる TMT 標識サンプルの数が増加します (17、38)。分析では合計 6,487 個のペプチドが特定され、96 件のケースで 1,183 個のプロテオームにマッピングされました。私たちが発見したCSF分析と同様に、サンプルの少なくとも50%で定量化されたタンパク質のみがその後の計算に含まれ、データは年齢と性別の影響について回帰されました。これにより、792 個のプロテオームが最終的に定量化され、その 95% が見つかった CSF データセットでも同定されました。
(A) 最初に複製された CSF コホートで検証され、最終パネルに含まれる脳関連 CSF タンパク質標的 (n = 60)。 (B ～ E) 4 つの CSF 複製コホートで測定されたパネル バイオマーカー レベル (複合 Z スコア)。対応のある t 検定または Tukey の後補正を備えた ANOVA を使用して、各反復分析における存在量の変化の統計的有意性を評価しました。 CT、コントロール。
私たちは、包括的な分析を通じて 271 の脳関連 CSF ターゲットを検証することに特に興味があるため、この複製されたプロテオームのさらなる検査をこれらのマーカーに限定します。これら 271 個のタンパク質のうち、100 個が CSF 複製 1 で検出されました。図 S6A は、対照サンプルと AD 複製サンプル間でのこれら 100 個の重複マーカーの発現差を示しています。シナプスおよび代謝産物のヒストンはアルツハイマー病で最も増加しますが、血管タンパク質は病気で最も減少します。 100 個の重複マーカー (n = 70) のほとんどは、2 つのデータセットで同じ変化方向を維持しました (図 S6B)。これらの 70 個の検証された脳関連 CSF マーカー (表 S2H) は、以前に観察されたパネル発現傾向、つまり血管タンパク質の下方制御と他のすべてのパネルの上方制御を主に反映しています。これら 70 個の検証されたタンパク質のうち、これらのパネルの傾向と矛盾する AD 存在量の変化を示したのは 10 個だけでした。脳と脳脊髄液の全体的な傾向を最もよく反映するパネルを作成するために、最終的に検証した対象のパネルからこれら 10 個のタンパク質を除外しました (図 5A)。したがって、我々のパネルには、最終的に、異なるサンプル前処理と MS プラットフォーム分析を使用して 2 つの独立した CSF AD コホートで検証された合計 60 個のタンパク質が含まれます。 CSF コピー 1 対照および AD 症例におけるこれらの最終パネルの Z スコア発現プロットは、我々が見つけた CSF コホートで観察されたパネル傾向を確認しました (図 5B)。
これら 60 種類のタンパク質の中には、多くの研究で AD と関連している炎症促進性サイトカインであるオステオポンチン (SPP1) やシナプスタンパク質である GAP43 など、AD と関連することが知られている分子があります (39-41)。それは明らかに神経変性と関連しています(42)。最も完全に検証されたタンパク質は、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 関連のスーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) やパーキンソン病関連の脱糖酵素 (PARK7) など、他の神経変性疾患に関連するマーカーです。また、SMOC1 や脳に富む膜付着シグナル伝達タンパク質 1 (BASP1) などの他の多くのマーカーが、これまでの神経変性との関連を限定していることも確認しました。 CSF プロテオームにおける全体的な存在量が低いため、MAPT および他の特定の AD 関連タンパク質 (NEFL や NRGN など) を確実に検出するためにこのハイスループットのシングルショット検出法を使用するのは困難であることは注目に値します。 ）（43、44）。
次に、これらの 60 個の優先パネル マーカーを 3 回の追加の反復分析で確認しました。 CSF コピー 2 では、単一の TMT-MS を使用して、Emory Goizueta ADRC からの 297 個の対照および AD サンプルの独立したコホートを分析しました (17)。 CSF 複製 3 には、スイス、ローザンヌの 120 人の対照患者および AD 患者から得られた入手可能な TMT-MS データの再解析が含まれていました (45)。各データセットで 60 個の優先マーカーのうち 3 分の 2 以上が検出されました。スイスの研究では異なる MS プラットフォームと TMT 定量化方法が使用されましたが (45、46)、我々は 2 回の反復分析でパネルの傾向を強く再現しました (図 5、C および D、および表 S2、I、および J)。私たちのグループの疾患特異性を評価するために、TMT-MS を使用して 4 番目の複製データセット (CSF 複製 4) を分析しました。これには、対照 (n = 18) および AD (n = 17) 症例だけでなく、PD ( n = 14))、ALS (n = 18)、および前頭側頭型認知症 (FTD) のサンプル (n = 11) (表 S1A)。このコホートのパネルタンパク質のほぼ 3 分の 2 (60 個中 38 個) の定量化に成功しました。これらの結果は、5 つのバイオマーカー パネルすべてにおける AD 特異的な変化を強調しています (図 5E および表 S2K)。代謝産物グループの増加は最も強い AD 特異性を示し、次に髄鞘形成グループとグリア グループが続きました。程度は低いですが、FTD はこれらのパネル間での増加も示しており、これは同様の潜在的なネットワーク変化を反映している可能性があります (17)。対照的に、ALS と PD は、対照群とほぼ同じ髄鞘形成、グリア、メタボロームのプロファイルを示しました。全体として、サンプル調製、MS プラットフォーム、および TMT 定量化方法の違いにもかかわらず、これらの繰り返しの分析は、当社の優先パネル マーカーが 500 を超える固有の CSF サンプルにおいて非常に一貫性のある AD 特異的変化を示すことを示しています。
AD 神経変性は、認知症状が発症する数年前から広く認識されているため、AsymAD のバイオマーカーが緊急に必要とされています (5, 31)。しかし、AsymAD の生物学は均一とは程遠く、リスクと回復力の複雑な相互作用がその後の疾患の進行に大きな個人差をもたらすことを示す証拠が増えています (47)。 AsymAD 症例を特定するために使用されていますが、コア CSF バイオマーカー (Aβ1-42、総タウおよび p-タウ) のレベルは、誰が認知症に進行するかを確実に予測できることは証明されていません (4, 7)。この集団のリスクを正確に層別化するためには、脳生理学の複数の側面に基づいた総合的なバイオマーカー ツールを含める必要があります。したがって、我々はその後、CSF コピー 1 の AsymAD 集団における AD で検証されたバイオマーカー パネルを分析しました。これら 31 人の AsymAD 症例は、異常なコア バイオマーカー レベル (Aβ1-42/総タウ ELISA 比、<5.5) と完全な認知 (平均 MoCA、27.1) を示しました。 ± 2.2) (表 S1A)。さらに、AsymAD 患者全員の臨床認知症スコアは 0 であり、日常の認知能力または機能パフォーマンスの低下の証拠がないことを示しています。
まず、AsymAD コホートを含む、CSF 複製 1 の 96 個すべてにおける検証済みパネルのレベルを分析しました。 AsymAD グループのいくつかのパネルでは AD 様の有意な存在量変化があり、血管パネルでは AsymAD の減少傾向が示された一方、他のすべてのパネルでは増加傾向が示されたことがわかりました (図 6A)。したがって、すべてのパネルは、ELISA Aβ1-42 および総タウ レベルとの非常に有意な相関関係を示しました (図 6B)。対照的に、グループと MoCA スコアの間の相関は比較的低いです。これらの分析で得られたより顕著な発見の 1 つは、AsymAD コホートにおけるパネル存在量の範囲が広いことです。図 6A に示すように、AsymAD グループのパネル レベルは通常、コントロール グループおよび AD グループのパネル レベルと交差しており、比較的高い変動性を示しています。 AsymAD のこの不均一性をさらに調査するために、96 件の CSF 複製 1 症例に多次元尺度法 (MDS) 分析を適用しました。 MDS 分析を使用すると、データセット内の特定の変数に基づいてケース間の類似性を視覚化できます。このクラスター分析では、CSF 発見および複製 1 プロテオーム (n = 29) (表 S2L) レベルに統計的に有意な変化 (P <0.05、AD/対照) がある検証済みのパネル マーカーのみを使用します。この分析により、対照症例と AD 症例の間に明確な空間クラスタリングが生成されました (図 6C)。対照的に、一部の AsymAD 症例は明らかに対照群に集中していますが、他の症例は AD 症例に位置しています。この AsymAD の不均一性をさらに調査するために、MDS マップを使用して、これらの AsymAD 症例の 2 つのグループを定義しました。最初のグループには、対照に近いクラスターに分類された AsymAD 症例が含まれていました (n = 19)。一方、2 番目のグループは、AD に近いマーカー プロファイルを持つ AsymAD 症例によって特徴付けられました (n = 12)。
(A) AsymAD を含む、CSF 複製 1 コホートの 96 サンプルすべてにおける CSF バイオマーカー グループの発現レベル (Z スコア)。 Tukey の事後補正による分散分析を使用して、パネル存在量の変化の統計的有意性を評価しました。 (B) ELISA Aβ1-42 および CSF コピー 1 サンプルにおけるパネルタンパク質存在量レベル (Z スコア) と MoCA スコアおよび総タウレベルの相関分析。関連する P 値を伴うピアソン相関係数が表示されます。 (C) CSF コピー 1 症例 96 例の MDS は、29 個の検証済みパネル マーカーの存在量レベルに基づいており、発見データセットと CSF コピー 1 データセットの両方で有意に変化しました [P <0.05 AD/対照 (CT)]。この分析は、AsymAD グループをコントロール (n = 19) と AD (n = 12) のサブグループに分けるために使用されました。 (D) ボルケーノ プロットは、2 つの AsymAD サブグループ間の -log10 統計 P 値に対する log2 倍率変化 (x 軸) を持つすべての CSF 複製 1 タンパク質の差次的発現を示します。パネルのバイオマーカーは色付きです。 (E) 選択グループのバイオマーカーの CSF 複製 1 存在量レベルは、AsymAD サブグループ間で差次的に発現されます。 Tukey の事後調整分散分析を使用して、統計的有意性を評価しました。
これらの対照症例とAD様AsymAD症例の間の異なるタンパク質発現を調べました（図6Dおよび表S2L）。結果として得られた火山地図は、14 個のパネル マーカーが 2 つのグループ間で大幅に変化していることを示しています。これらのマーカーのほとんどは、シナプスおよびメタボロームのメンバーです。しかし、それぞれミエリン免疫グループとグリア免疫グループのメンバーであるSOD1とミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼC基質(MARCKS)もこのグループに属します(図6、DおよびE)。血管パネルは、AE 結合タンパク質 1 (AEBP1) および補体ファミリー メンバー C9 を含む、AD 様 AsymAD グループで有意に減少した 2 つのマーカーにも寄与しました。 ELISA AB1-42 (P = 0.38) および p-タウ (P = 0.28) では、コントロールと AD 様 AsymAD サブグループの間に有意差はありませんでしたが、総タウ レベルには確かに有意差がありました (P = 0.0031) ）（図S7）。 2 つの AsymAD サブグループ間の変化が総タウ レベルよりも重要であることを示すパネル マーカーがいくつかあります (たとえば、YWHAZ、SOD1、MDH1) (図 6E)。全体として、これらの結果は、私たちの検証されたパネルに、無症候性疾患の患者のサブタイプと潜在的なリスク層別化を可能にするバイオマーカーが含まれている可能性があることを示しています。
ADの背後にあるさまざまな病態生理学をより適切に測定し、標的とするシステムベースのバイオマーカーツールが緊急に必要とされています。これらのツールは、AD 診断の枠組みを変えるだけでなく、効果的な患者固有の治療戦略の採用を促進すると期待されています (1、2)。この目的を達成するために、我々は偏りのない包括的なプロテオミクスアプローチをアルツハイマー病の脳とCSFに適用し、広範囲の脳ベースの病態生理学を反映するウェブベースのCSFバイオマーカーを同定した。私たちの分析により、(i) シナプス、血管、ミエリン、免疫および代謝機能障害を反映する 5 つの CSF バイオマーカー パネルが生成されました。 (ii) さまざまな MS プラットフォームでの強力な再現性を実証します。 ( iii) AD の初期段階および後期段階を通じて、進行性の疾患特有の変化を示します。全体として、これらの発見は、アルツハイマー病の研究および臨床応用のための、多様で信頼性の高いウェブ指向のバイオマーカー ツールの開発に向けた有望な一歩を示しています。
我々の結果は、AD脳ネットワークプロテオームの高度に保存された構成を実証し、システムベースのバイオマーカー開発のアンカーとしてのその使用を裏付ける。私たちの分析は、AD 脳と AsymAD 脳を含む 2 つの独立した TMT-MS データセットが強力なモジュール性を持っていることを示しています。これらの発見は我々の以前の研究を拡張し、前頭葉皮質、頭頂葉皮質、および側頭葉皮質における複数の独立したコホートからの2,000以上の脳組織の強力なモジュールが保存されていることを実証した(17)。このコンセンサスネットワークは、グリアが豊富な炎症モジュールの増加やニューロンが豊富なモジュールの減少など、現在の研究で観察されているさまざまな疾患関連の変化を反映しています。現在の研究と同様に、この大規模ネットワークも AsymAD におけるモジュールの重要な変化を特徴としており、さまざまな異なる前臨床病態生理学を示しています (17)。
しかし、この非常に保守的なシステムベースの枠組み内では、特にアルツハイマー病の初期段階にある個人の間では、よりきめの細かい生物学的不均一性が存在します。私たちのバイオマーカー パネルは、複数の CSF マーカーの有意な発現差を示す AsymAD の 2 つのサブグループを描写することができます。私たちのグループは、これら 2 つのサブグループ間の生物学的差異を強調することができましたが、これらはコア AD バイオマーカーのレベルでは明らかではありませんでした。対照群と比較して、これらの AsymAD 患者の Aβ1-42/総タウ比は異常に低かった。ただし、2 つの AsymAD サブグループ間で有意に異なっていたのは総タウ レベルのみであり、Aβ1-42 および p-タウ レベルは比較的同等のままでした。 CSF タウが高いことは、Aβ1-42 レベルよりも認知症状のより良い予測因子であると思われる (7) ため、2 つの AsymAD コホートには疾患進行の異なるリスクがあるのではないかと考えられます。 AsymAD のサンプルサイズが限られており、長期的なデータが不足していることを考慮すると、自信を持ってこれらの結論を導き出すにはさらなる研究が必要です。しかし、これらの結果は、システムベースのCSFパネルが、疾患の無症候性段階で個人を効果的に階層化する能力を強化できることを示しています。
全体として、我々の発見は、AD の病因における複数の生物学的機能の役割を裏付けています。しかし、エネルギー代謝の調節不全は、検証済みの 5 つのラベルパネルすべての顕著なテーマとなりました。ヒポキサンチン-グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ 1 (HPRT1) や乳酸デヒドロゲナーゼ A (LDHA) などの代謝タンパク質は、最も確実に検証されたシナプス バイオマーカーであり、AD CSF の増加が性の再現性が高いことを示しています。私たちの血管やグリアパネルには、酸化物質の代謝に関与するいくつかのマーカーも含まれています。これらの発見は、ニューロンの高いエネルギー要求を満たすだけでなく、星状膠細胞や他のグリア細胞の高いエネルギー要求を満たすという代謝プロセスが脳全体で果たす重要な役割と一致しています(17、48)。我々の結果は、酸化還元電位の変化とエネルギー経路の遮断が、ミトコンドリア障害、グリア媒介炎症、血管損傷など、アルツハイマー病の発症に関与するいくつかの重要なプロセスの間の中心的なつながりである可能性があるという証拠の増加を裏付けるものである(49)。さらに、代謝性脳脊髄液バイオマーカーには、対照群とアルツハイマー病様AsymADサブグループ間で異なる豊富なタンパク質が多数含まれており、これらのエネルギーおよび酸化還元経路の破壊が疾患の前臨床段階で重要である可能性があることが示唆されています。
私たちが観察したさまざまな脳および脳脊髄液パネルの傾向には、興味深い生物学的意味もあります。ニューロンが豊富なシナプスおよびメタボロームは、アルツハイマー病脳内のレベルの低下と脳脊髄液中の存在量の増加を示します。ニューロンには、多数の特殊なシグナルにエネルギーを供給するためにシナプスにエネルギーを生成するミトコンドリアが豊富に存在することを考えると (50)、これら 2 つのニューロン グループの発現プロファイルの類似性が予想されます。ニューロンの喪失と損傷した細胞の押し出しは、病気の後期におけるこれらの脳およびCSFパネルの傾向を説明できますが、それらは私たちが観察する初期のパネル変化を説明することはできません(13)。初期の無症候性疾患におけるこれらの所見について考えられる説明の 1 つは、異常なシナプス刈り込みです。マウスモデルにおける新たな証拠は、アルツハイマー病においてミクログリア媒介シナプス食作用が異常に活性化され、脳における早期シナプス喪失を引き起こす可能性があることを示唆している(51)。この廃棄されたシナプス物質は CSF に蓄積する可能性があり、これがニューロンパネルで CSF の増加を観察する理由です。免疫介在性のシナプス刈り込みも、病気の過程を通じて脳や脳脊髄液で観察されるグリアタンパク質の増加を部分的に説明できる可能性があります。シナプスの剪定に加えて、エキソサイトーシス経路の全体的な異常も、脳およびCSFのニューロンマーカーの発現の違いを引き起こす可能性があります。多くの研究は、AD 脳の病因におけるエキソソームの含有量が変化したことを示しています (52)。細胞外経路は Aβ の増殖にも関与しています (53、54)。エクソソーム分泌の抑制により、AD トランスジェニックマウスモデルにおける AD 様の病状が軽減される可能性があることは注目に値します (55)。
同時に、血管パネルのタンパク質はアルツハイマー病脳では中程度の増加を示しましたが、CSFでは大幅に減少しました。血液脳関門（BBB）の機能不全は、これらの所見を部分的に説明できる可能性があります。多くの独立した人間の死後研究は、アルツハイマー病におけるBBBの破壊を実証している(56, 57)。これらの研究では、脳毛細管漏出や血液由来タンパク質の血管周囲蓄積など、この密閉された内皮細胞層の周囲のさまざまな異常な活動が確認されました (57)。これは、脳内の血管タンパク質の増加については簡単に説明できますが、脳脊髄液におけるこれらの同じタンパク質の減少については完全には説明できません。可能性の 1 つは、炎症と酸化ストレスの増加の問題を解決するために、中枢神経系がこれらの分子を積極的に隔離しているということです。このパネルにおける最も重度の CSF タンパク質の一部、特にリポタンパク質制御に関与するタンパク質の減少は、有害なレベルの炎症の抑制と活性酸素種の神経保護プロセスに関連しています。これは、循環中の酸化ストレスレベルの低下に関与するリポタンパク質結合酵素であるパロキソナーゼ 1 (PON1) にも当てはまります (58, 59)。アルファ-1-ミクログロブリン/ビクニン前駆体 (AMBP) は、血管群のもう 1 つの有意に下方制御されたマーカーです。これは脂質輸送体ビクニンの前駆体であり、炎症抑制や神経保護にも関与しています (60, 61)。
さまざまな興味深い仮説にもかかわらず、生化学的な疾患メカニズムを直接検出できないことは、発見主導型プロテオミクス解析のよく知られた限界です。したがって、これらのバイオマーカーパネルの背後にあるメカニズムを自信を持って定義するには、さらなる研究が必要です。 MS ベースの臨床分析の開発に向けて進むためには、将来の方向性としては、選択的反応モニタリングや並行反応モニタリングなど、大規模なバイオマーカー検証のための標的を絞った定量的手法の使用も必要です (62)。我々は最近、並行反応モニタリング (63) を使用して、ここで説明する CSF タンパク質の変化の多くを検証しました。 YWHAZ、ALDOA、SMOC1など、いくつかの優先パネルターゲットがかなりの精度で定量化されており、それぞれシナプス、代謝、炎症パネルにマッピングされています(63)。独立データ取得 (DIA) およびその他の MS ベースの戦略も、ターゲットの検証に役立つ場合があります。バドら。 (64) 最近、我々の CSF 発見データセットと、ヨーロッパの 3 つの異なるコホートからの 200 近くの CSF サンプルで構成される独立した DIA-MS データセットで特定された AD バイオマーカーとの間に、重大な重複があることが実証されました。これらの最近の研究は、当社のパネルが信頼性の高い MS ベースの検出に変わる可能性を裏付けています。従来の抗体およびアプタマーに基づく検出も、主要な AD バイオマーカーのさらなる開発にとって重要です。 CSF の量が少ないため、ハイスループット MS 法を使用してこれらのバイオマーカーを検出することはより困難です。 NEFL と NRGN は、低存在量 CSF バイオマーカーの 2 つの例であり、当社の包括的な分析ではパネルにマッピングされていますが、当社の単一 MS 戦略を使用して確実に検出することはできません。 PEA などの複数の抗体に基づくターゲティング戦略は、これらのマーカーの臨床的変化を促進する可能性があります。
全体として、この研究は、さまざまなシステムに基づいて CSF AD バイオマーカーを同定および検証するための独自のプロテオミクス アプローチを提供します。追加の AD コホートおよび MS プラットフォームにわたってこれらのマーカーパネルを最適化することは、AD リスクの層別化と治療を前進させる可能性があることが証明される可能性があります。これらのパネルの長期的なレベルを経時的に評価する研究も、どのマーカーの組み合わせが早期疾患のリスクと疾患重症度の変化を最もよく層別化するかを決定するために重要です。
CSF によってコピーされた 3 つのサンプルを除いて、この研究で使用されたすべての CSF サンプルは、Emory ADRC または密接に関連する研究機関の後援の下で収集されました。これらのプロテオミクス研究では、合計 4 セットの Emory CSF サンプルが使用されました。 CSF コホートには、20 人の健康な対照と 20 人の AD 患者からのサンプルが含まれていることが判明しました。 CSF コピー 1 には、32 人の健康な対照、31 人の AsymAD 患者、および 33 人の AD 患者からのサンプルが含まれています。 CSF コピー 2 には、147 個のコントロールと 150 個の AD サンプルが含まれています。多疾患CSF複製4コホートには、18個の対照、17個のAD、19個のALS、13個のPD、および11個のFTDサンプルが含まれていた。エモリー大学治験審査委員会によって承認された合意に従って、エモリー研究の参加者全員がインフォームドコンセントを得ました。 2014 年の国立老化研究所のアルツハイマー病センターのベスト プラクティス ガイドライン (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) によると、脳脊髄液は腰椎穿刺によって収集および保存されました。対照患者、AsymAD 患者および AD 患者は、Emory Cognitive Neurology Clinic または Goizueta ADRC で標準化された認知評価を受けました。彼らの脳脊髄液サンプルは、ELISA Aβ1-42、総タウおよび p-タウ分析について INNO-BIA AlzBio3 Luminex によってテストされました (65)。 ELISA 値は、確立された AD バイオマーカーのカットオフ基準に基づいて被験者の診断分類をサポートするために使用されます (66、67)。他の CSF 診断 (FTD、ALS、および PD) の基本的な人口統計および診断データも、Emory ADRC または関連研究機関から入手されます。これらの Emory CSF 症例の症例メタデータの概要は、表 S1A にあります。 Swiss CSF 複製 3 コホートの特徴は以前に発表されています (45)。
CSFがサンプルを発見した。 CSFデータセットの発見をさらに深くするために、トリプシン処理の前に高濃度タンパク質の免疫消費を実施しました。つまり、40 の個別の CSF サンプルからの 130 μl の CSF と等量 (130 μl) の High Select Top14 Abundance Protein Depletion 樹脂 (Thermo Fisher Scientific、A36372) を、室温のスピンカラム (Thermo Fisher Scientific、A89868) に入れました。温度インキュベート)。 15 分間回転させた後、サンプルを 1000g で 2 分間遠心分離します。 3K 超遠心分離フィルター デバイス (Millipore、UFC500396) を使用して、14,000 g で 30 分間遠心分離することによって流出サンプルを濃縮しました。全サンプル量をリン酸緩衝生理食塩水で 75 μl に希釈します。タンパク質濃度は、製造業者（Thermo Fisher Scientific）のプロトコールに従ってビシンコニン酸（BCA）法によって評価されました。 40 サンプルすべてからの免疫枯渇した CSF (60 μl) をリシル エンドペプチダーゼ (LysC) とトリプシンで消化しました。つまり、サンプルを1.2μlの0.5Mトリス-2(-カルボキシエチル)-ホスフィンおよび3μlの0.8Mクロロアセトアミドを用いて90℃で10分間還元およびアルキル化し、その後水浴中で15分間超音波処理した。サンプルを１９３μｌの８Ｍ尿素緩衝液［８Ｍ尿素および１００ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ８．５）］で最終濃度６Ｍ尿素まで希釈した。 LysC (4.5 μg; Wako) を室温での一晩の消化に使用します。次に、サンプルを 50 mM 重炭酸アンモニウム (ABC) で 1 M 尿素に希釈しました (68)。等量 (4.5 μg) のトリプシン (Promega) を加え、サンプルを 12 時間インキュベートします。消化されたペプチド溶液を最終濃度 1% ギ酸 (FA) および 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) まで酸性化し (66)、次に上記のように 50 mg Sep-Pak C18 カラム (Waters) で脱塩します (25)。 。次いで、ペプチドを１ｍｌの５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）中で溶出した。バッチ全体でタンパク質の定量を標準化するために (25)、40 個の CSF サンプルすべてからの 100 μl アリコートを組み合わせて混合サンプルを生成し、それを 5 つのグローバル内部標準 (GIS) (48) サンプルに分割しました。すべての個々のサンプルと組み合わせた標準は、高速真空 (Labconco) によって乾燥されます。
CSF はサンプルをコピーします。 Dayonらは以前、CSFコピー3サンプルの免疫枯渇と消化について報告している(45、46)。残りの複製サンプルは個別に免疫除去されませんでした。前述のように、これらの除去されていないサンプルをトリプシンで消化します (17)。分析を繰り返すたびに、各サンプルから溶出したペプチドの 120 μl アリコートを一緒にプールし、TMT 標識グローバル内部標準として使用するために等量のアリコートに分割しました (48)。すべての個々のサンプルと組み合わせた標準は、高速真空 (Labconco) によって乾燥されます。低存在量の CSF タンパク質のシグナルを増強するために、各サンプルから 125 μl を組み合わせて、各反復分析用に「増強された」サンプルを調製しました [つまり、研究サンプルを模倣した生物学的サンプルですが、利用可能な量ははるかに大きい (37, 69)] が混合 CSF サンプルに統合されました (17)。次に、混合サンプルを 12 ml の High Select Top14 Abundance タンパク質除去樹脂 (Thermo Fisher Scientific、A36372) を使用して免疫除去し、上記のように消化し、その後の複数の TMT 標識に含めました。