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好熱菌は、高温で増殖する微生物です。それらを研究することで、生命が極限状態にどのように適応するかについて貴重な情報が得られます。しかし、従来の光学顕微鏡では高温条件を達成することが困難でした。局所抵抗電気加熱に基づく自家製の解決策がいくつか提案されていますが、簡単な商用解決策はありません。この論文では、ユーザーの環境を穏やかに保ちながら、好熱菌の研究に高温を提供する、顕微鏡の視野全体にわたるマイクロスケールのレーザー加熱の概念を紹介します。生体適合性があり効率的な光吸収体として金ナノ粒子でコーティングされた基板を使用すると、適度なレーザー強度でのマイクロスケール加熱を実現できます。マイクロスケールの流体対流、細胞保持、および遠心熱泳動運動の考えられる影響について説明します。この方法は 2 つの種で実証されています。(i) Geobacillus stearothermophilus は、約 65℃で繁殖する活性な好熱性細菌で、マイクロスケールの加熱下で発芽、成長、遊泳することが観察されています。 (ii) Thiobacillus sp.、最適な超好熱性古細菌。 80℃で。この研究は、最新の手頃な価格の顕微鏡ツールを使用して、好熱性微生物を簡単かつ安全に観察するための道を開きます。
何十億年にもわたって、地球上の生命は、人間の観点からは時には極端であると考えられる幅広い環境条件に適応するように進化してきました。特に、好熱菌と呼ばれる一部の好熱性微生物（細菌、古細菌、真菌）は、45℃から122℃の温度範囲で繁殖します1,2,3,4。好熱菌は、深海の熱水噴出孔、温泉などのさまざまな生態系に生息しています。または火山地帯。彼らの研究は、少なくとも 2 つの理由から、過去数十年にわたり多くの関心を集めてきました。まず、我々はそれらから、例えば、好熱菌 5、6、酵素 7、8、膜 9 がどのようにしてそのような高温で安定しているのか、あるいは好熱菌がどのようにして極端なレベルの放射線に耐えることができるのかを学ぶことができます 10。第二に、それらは、燃料生産 13,14,15,16、化学合成 (ジヒドロ、アルコール、メタン、アミノ酸など)17、バイオマイニング 18、熱安定性生体触媒 7、11 など、多くの重要なバイオテクノロジー応用 1,11,12 の基礎となっています。 13.特に、現在よく知られているポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)19 には、最初に発見された好熱菌の 1 つである好熱性細菌 Thermus aquaticus から単離された酵素 (Taq ポリメラーゼ) が関与しています。
しかし、好熱菌の研究は簡単な作業ではなく、どの生物学実験室でも即席でできるものではありません。特に、生きた好熱菌は、標準的な光学顕微鏡では、通常 40℃ 程度の温度に定格されている市販の加熱チャンバーを使用しても、in vitro で観察することはできません。 1990 年代以来、高温顕微鏡 (HTM) システムの導入に専念してきた研究グループはわずか数グループだけでした。 1994 年に Glukh ら。加熱/冷却チャンバーは、嫌気性を維持するために閉じられた長方形の毛細管の温度を制御するペルチェ セルの使用に基づいて考案されました 20 。このデバイスは 2 °C/秒の速度で 100 °C まで加熱でき、著者らは超好熱性細菌 Thermotoga maritima の運動性を研究することができます 21。 1999 年にホーンら。非常によく似た装置が開発されていますが、これは依然として細胞の分裂/結合を研究するための商用顕微鏡に適した加熱毛細管の使用に基づいています。長期間比較的活動がなかった後、効果的な HTM の探索が 2012 年に再開されました。特に、Horn らによって発明されたデバイスを使用した Wirth グループによる一連の論文に関連して、効果的な HTM の探索が再開されました。 15 年前、超好熱菌を含む多数の古細菌の運動性が、加熱された毛細管を使用して 100°C までの温度で研究されました 23,24。彼らはまた、元の顕微鏡を改良して、より高速な加熱（設定温度に達するまでに 35 分ではなく数分）を達成し、培地全体で 2 cm を超える直線温度勾配を達成しました。この温度勾配成形装置 (TGFD) は、生物学的に適切な距離における温度勾配内での多くの好熱菌の移動性を研究するために使用されています 24、25 。
生きた好熱菌を観察する方法は、閉じた毛細管を加熱することだけではありません。 2012 年に桑原ら。耐熱性接着剤でシールされた自家製の使い捨てパイレックスチャンバー（スーパー X2、セメダイン、日本）を使用しました。サンプルは、110℃まで加熱できる市販の透明加熱プレート（Micro Heat Plate、Kitazato Corporation、日本）上に配置されましたが、本来はバイオイメージングを目的としたものではありませんでした。著者らは、65℃で嫌気性好熱性細菌（Thermosipho globiformans、倍加時間24分）の効率的な分裂を観察した。 2020 年に、パルシェンらは市販の金属皿 (AttofluorTM、Thermofisher) の効率的な加熱は、蓋とステージ (PCR 装置にヒントを得た構成) という 2 つの自家製加熱要素を使用して実証されました。この関係により、液体の温度が均一になり、蓋の底での蒸発や結露が防止されます。 Oリングの使用により、環境とのガス交換が回避されます。スルフォスコープと呼ばれるこの HTM は、75℃でスルフォロブス アシドカルダリウスの画像化に使用されました27。
これらすべてのシステムで認識されている制限は、空気対物レンズの使用に対する制限であり、油浸はそのような高温や厚さ 1 mm を超える透明なサンプルのイメージングには適していません。 これらすべてのシステムで認識されている制限は、空気対物レンズの使用に対する制限であり、油浸はそのような高温や厚さ 1 mm を超える透明なサンプルのイメージングには適していません。 Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование объективов, поскольку ое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образе цы толщиной > 1分。 これらすべてのシステムで認識されている欠点は、空気対物レンズの使用が制限されていることです。これは、油浸はそのような高温や厚さ 1 mm を超える透明なサンプルを通した可視化には適していないためです。これらすべてのシステムの公知の制限の 1 つは、空気浸漬の使用が制限されていることであり、いかなる油浸もそのような高温および 1 メートルを超える厚さの透明サンプルの形成には適さないということです。 これらすべてのシステムで認識されている制限は、空気混入ミラーの使用の制限です。油浸はそのような高温で厚さ 1 mm を超える透明なサンプルのイメージングには適さないためです。 Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование объективов, любое сионное погружение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцной > 1分 これらすべてのシステムで認識されている欠点は、空気レンズの使用が制限されていることです。油浸はそのような高温や厚さ 1 mm を超える透明なサンプルを通した可視化には適していません。最近になって、この制限は Charles-Orzag らによって解除されました。彼は、対象となるシステムの周囲に熱を供給するのではなく、ITO (酸化インジウムスズ) 製の薄い透明な抵抗層で覆われたカバー ガラス自体の内部に熱を供給するデバイスを開発しました。透明層に電流を流すことで、蓋を 75 °C まで加熱できます。ただし、レンズを損傷しないように、対物レンズを 65 °C 以下で加熱する必要があります。
これらの研究は、効率的な高温光学顕微鏡の開発が広く採用されておらず、多くの場合、自家製の装置を必要とし、多くの場合、空間分解能を犠牲にして達成されることを示しているが、これは、好熱性微生物が数個しかないことを考えると重大な欠点である。マイクロメートル。加熱量の削減は、HTM に固有の 3 つの問題、つまり、空間分解能の低下、システム加熱時の高い熱慣性、および極端な温度での周囲の要素 (浸漬油、対物レンズ…、またはユーザーの手) の有害な加熱を解決する鍵となります。 ）。
この論文では、抵抗加熱に基づいていない好熱菌観察のための HTM を紹介します。その代わりに、光吸収基板にレーザーを照射することで、顕微鏡の視野の限られた領域内で局所的な加熱を実現しました。温度分布は定量的位相顕微鏡 (QPM) を使用して視覚化されました。この方法の有効性は、約65℃で増殖し、倍加時間が短い（約20分）運動性好熱性細菌であるGeobacillus stearothermophilusと、80℃で最適に増殖する超好熱菌（古細菌）であるSulfolobus shibataeによって実証されています。説明するために。正常な複製速度と遊泳が温度の関数として観察されました。このレーザー HTM (LA-HTM) は、カバースリップの厚さや対物レンズの性質 (空気浸漬または油浸漬) によって制限されません。これにより、市販されているあらゆる高解像度レンズを使用できるようになります。また、熱慣性による加熱の遅れが発生せず（ミリ秒スケールでの即時加熱を実現）、市販のコンポーネントのみを使用します。唯一の新たな安全上の懸念は、デバイス内部および場合によっては目を通過する強力なレーザー光線 (通常は最大 100 mW) の存在に関連しており、保護ゴーグルが必要です。
LA-HTM の原理は、レーザーを使用して顕微鏡の視野内でサンプルを局所的に加熱することです (図 1a)。これを行うには、サンプルが光を吸収する必要があります。適切なレーザー出力（100 mW未満）を使用するために、液体媒体による光の吸収に依存せず、基板を金ナノ粒子でコーティングすることでサンプルの吸収を人工的に増加させました（図1c）。金ナノ粒子を光で加熱することは、熱プラズモニクスの分野にとって基本的に重要であり、生物医学、ナノ化学、または太陽光発電への応用が期待されています29、30、31。過去数年間にわたり、私たちは物理学、化学、生物学における熱プラズマ応用に関連するいくつかの研究でこの LA-HTM を使用してきました。この方法の主な困難は、高温がサンプル内のマイクロスケール領域に限定されるため、最終的な温度プロファイルを表示することです。我々は、二次元回折格子 (クロス格子とも呼ばれる) の使用に基づく定量的位相顕微鏡のシンプルで高分解能かつ非常に高感度な方法である 4 波長横シア干渉計を使用して温度マッピングを実現できることを示しました。 33、34、35、36。交差回折格子波面顕微鏡 (CGM) に基づくこの熱顕微鏡技術の信頼性は、過去 10 年間に発表された十数の論文で実証されています 37,38,39,40,41,42,43。
平行レーザー加熱、成形および温度顕微鏡の設置スキーム。 b 金ナノ粒子でコーティングされたカバースリップを含む AttofluorTM チャンバーで構成されるサンプル形状。 c サンプルをよく見てください (縮尺は一定ではありません)。 dは均一なレーザービームプロファイルを表し、(e)金ナノ粒子のサンプル面上のシミュレートされたその後の温度分布を表します。 f は、(g) に示されている結果の温度分布のシミュレーションに示されているように、均一な温度を生成するのに適した環状レーザー ビーム プロファイルです。スケールバー: 30 μm。
特に、我々は最近、LA-HTM および CGM を使用した哺乳動物細胞の加熱を達成し、37 ～ 42 °C の範囲で細胞の熱ショック応答を追跡し、この技術が単一生細胞イメージングに適用できることを実証しました。ただし、LA-HTM を高温での微生物の研究に応用することは、哺乳類の細胞に比べてより注意が必要であるため、明確ではありません。まず、培地の底を (数度ではなく) 数十度加熱すると、強い垂直温度勾配にさらされます。基板にしっかりと付着していないと、流体の対流４４が生じる可能性があり、バクテリアの望ましくない移動や混合を引き起こす可能性がある。この対流は、液層の厚さを薄くすることで解消できます。この目的のために、以下に示すすべての実験では、金属カップ内に配置された厚さ約 15 μm の 2 枚のカバースリップの間に細菌懸濁液を配置しました (AttofluorTM、Thermofisher、図 1b、c)。原理的には、液体の厚さが加熱レーザーのビームサイズより小さければ、対流を回避できます。第二に、そのような限られた形状で作業すると、好気性生物が窒息する可能性があります（図S2を参照）。この問題は、酸素（またはその他の重要なガス）透過性の基板を使用するか、カバーガラス内に閉じ込められた気泡を残すか、上部のカバーガラスに穴を開けることで回避できます（図S1を参照） 45 。この研究では、後者の解決策を選択しました (図 1b および S1)。最後に、レーザー加熱では均一な温度分布が得られません。レーザー光の強度が同じでも（図1d）、温度分布は均一ではなく、熱拡散によりガウス分布に似ています（図1e）。生物学的システムを研究するために視野内で正確な温度を確立することが目的である場合、不均一なプロファイルは理想的ではなく、細菌が基板に付着していない場合、細菌の熱泳動運動を引き起こす可能性もあります（図S3、S4を参照）。この目的を達成するために、空間光変調器（SLM）を使用して、サンプル面内のリング（図1f）の形状に従って赤外線レーザービームを整形し、所定の幾何学的領域内で完全に均一な温度分布を達成しました。熱拡散にもかかわらず (図 1d) 39、42、46。培地の蒸発を避けるために上部のカバーガラスを金属皿の上に置き (図 1b)、少なくとも数日間観察します。この上部カバースリップは密封されていないため、必要に応じていつでも追加の培地を簡単に追加できます。
LA-HTM がどのように機能するかを説明し、好熱性研究におけるその適用性を実証するために、約 60 ～ 65°C の最適増殖温度を持つ好気性細菌 Geobacillus stearothermophilus を研究しました。この細菌には鞭毛と遊泳能力もあり、正常な細胞活動のもう 1 つの指標となります。
サンプル (図 1b) を 60℃ で 1 時間プレインキュベートし、LA-HTM サンプルホルダーに置きました。このプレインキュベーションはオプションですが、次の 2 つの理由で有用です。 まず、レーザーをオンにすると、細胞がすぐに成長し、分裂します (補足資料のムービー M1 を参照)。プレインキュベーションを行わないと、サンプル上の新しい表示領域が加熱されるたびに、細菌の増殖が通常約 40 分遅れます。第二に、1 時間のプレインキュベーションによりカバースリップへの細菌の接着が促進され、レーザーをオンにしたときに熱泳動によって細胞が視野から外れることを防ぎました (補足資料のフィルム M2 を参照)。熱泳動は、通常は高温から低温への温度勾配に沿った粒子または分子の移動であり、細菌も例外ではありません 43,47。この望ましくない影響は、SLM を使用してレーザー ビームを整形し、平坦な温度分布を達成することによって、特定の領域にわたって排除されます。
図上。図2は、金ナノ粒子をコーティングしたガラス基板に環状レーザー光を照射して得られたCGMにより測定された温度分布を示しています（図1f）。レーザービームが照射された領域全体にわたって平坦な温度分布が観察されました。このゾーンは、最適な成長温度である 65°C に設定されました。この領域の外側では、温度曲線は自然に \(1/r\) まで下がります (\(r\) は動径座標です)。
環状レーザービームを使用して金ナノ粒子の層を照射し、円形領域全体にわたって平坦な温度プロファイルを取得することによって得られた CGM 測定の温度マップ。 b 温度マップの等温線 (a)。レーザービームの輪郭は灰色の点線の円で表されます。実験は 2 回繰り返されました (補足資料、図 S4 を参照)。
LA-HTM を使用して細菌細胞の生存率を数時間監視しました。図上。図３は、３時間２０分の映画（映画Ｍ３、補足情報）から撮影された４枚の画像の時間間隔を示す。細菌は、温度が最適な 65°C に近い、レーザーによって画定された円形領域内で活発に増殖することが観察されました。対照的に、温度が 10 秒間 50°C 以下に低下すると、細胞増殖は大幅に減少しました。
異なる時間でのレーザー加熱後に増殖する G. stearothermophilus 細菌の光学深度画像、(a) t = 0 分、(b) 1 時間 10 分、(c) 2 時間 20 分、(d) 3 時間 20 分。 200 対応する温度マップに重ねられた 1 分間のフィルム (補足情報で提供される M3 フィルム) から抽出されます。レーザーは時刻 \(t=0\) にオンになります。等温線が強度画像に追加されました。
細胞増殖とその温度依存性をさらに定量化するために、最初に分離された細菌のさまざまなコロニーのバイオマスの増加を Movie M3 の視野内で測定しました (図 4)。ミニコロニー形成単位（mCFU）形成の開始時に選択された親細菌を図S6に示します。乾燥質量の測定は、温度分布のマッピングに使用される CGM 48 カメラで行われました。乾燥重量と温度を測定できる CGM の機能が LA-HTM の強みです。予想どおり、高温により細菌の増殖が速くなりました (図 4a)。図4bの片対数プロットに示されているように、すべての温度での成長は指数関数的な成長に従います。データは指数関数 \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ を使用します） {{ \mbox{cst}}}\)、ここで \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – 生成時間 (または 2 倍化時間)、\( g =1/ \tau\) – 成長率 (単位時間あたりの分割数)。図上。図４ｃは、それぞれの成長速度および生成時間を温度の関数として示す。急速に増殖する mCFU は 2 時間後に増殖が飽和するという特徴があり、これは細菌密度が高いため予想される動作です (古典的な液体培養における定常期と同様)。一般的な形状\(g\left(T\right)\)（図4c）は、約60〜65℃で最適な増殖速度を有するG. stearothermophilusの予想される二相曲線に対応します。基本モデルを使用してデータを照合します (図 S5)49 ここで、 \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C、これは文献で引用されている他の値とよく一致します49。温度依存パラメータは再現可能ですが、\({G}_{0}\) の最大成長率は実験ごとに異なる場合があります (図 S7 ～ S9 およびムービー M4 を参照)。普遍的であるべき温度フィッティングパラメータとは対照的に、最大増殖速度は、観察されたマイクロスケール幾何学的形状内の培地の特性（栄養素の利用可能性、酸素濃度）に依存します。
a さまざまな温度での微生物の増殖。 mCFU: ミニチュアコロニー形成ユニット。温度勾配で増殖する単一の細菌のビデオから得られたデータ (ムービー M3)。 b (a) と同じ、片対数スケール。 c 線形回帰から計算された増殖率\(\tau\) と生成時間\(g\) (b)。水平誤差バー: 成長中に mCFU が視野に拡大した温度範囲。垂直誤差バー: 線形回帰標準誤差。
通常の増殖に加えて、レーザー加熱中に一部の細菌が視界に浮かぶことがありましたが、これは鞭毛を持つ細菌にとって予想される動作です。追加情報のムービーM5では、そんな水泳の様子を紹介しています。この実験では、図 1d、e、および S3 に示すように、均一なレーザー放射を使用して温度勾配を作成しました。図 5 は、M5 ムービーから選択された 2 つの画像シーケンスを示しており、1 つの細菌が方向性を持った動きを示す一方、他のすべての細菌は静止していることがわかります。
2 つの時間枠 (a) と (b) は、点線の円でマークされた 2 つの異なる細菌の遊泳を示しています。画像は M5 ムービー (補足資料として提供) から抽出されました。
G. stearothermophilus の場合、レーザー光がオンになってから数秒後に細菌の活発な動きが始まりました (図 5)。この観察は、Mora らによってすでに観察されているように、温度上昇に対するこの好熱性微生物の時間的応答を強調しています。 ２４． LA-HTM を使用すると、細菌の運動性や熱走性などのテーマをさらに詳しく調べることができます。
微生物の水泳を他の種類の物理的運動、すなわち、(i) 明確な方向のない混沌とした運動のように見えるブラウン運動、(ii) 温度に沿った規則的な運動のドリフトからなる対流 50 および熱泳動 43 と混同すべきではありません。勾配。
G. stearothermophilus は、防御として不利な環境条件にさらされたときに、高度に耐性のある胞子を生成する (胞子形成) 能力で知られています。環境条件が再び良好になると、胞子が発芽して生きた細胞を形成し、成長を再開します。この胞子形成/発芽プロセスはよく知られていますが、リアルタイムで観察されたことはありません。 LA-HTM を使用して、G. stearothermophilus における発芽イベントの最初の観察をここで報告します。
図上。図６ａは、１３個の胞子のＣＧＭセットを使用して得られた光学的深さ（ＯＴ）の微速度撮影画像を示す。収集時間全体 (15 時間 6 分、\(t=0\) – レーザー加熱の開始) において、連続する時点 \(t=2\) h、\( 3\ で 13 個の胞子のうち 4 個が発芽しました。 ) h \(10 \)'、\(9\) h \(40\)'、および \(11\) h \(30\)'。図6にはこれらのイベントのうちの1つだけが示されていますが、補足資料のM6ムービーでは4つの発芽イベントが観察できます。興味深いことに、発芽はランダムであるようです。環境条件の同じ変化にもかかわらず、すべての胞子が発芽するわけではなく、同時に発芽することもありません。
a 8 枚の OT 画像 (油浸、60 倍、NA 1.25 対物レンズ) と (b) G. stearothermophilus 凝集体のバイオマス進化。 c (b) 成長率の直線性を強調するために片対数スケールで描かれています (破線)。
図上。図６ｂ、ｃは、視野内の細胞集団のバイオマスを、データ収集の全期間にわたる時間の関数として示す。図の \(t=5\)h で観察された乾燥質量の急速な減衰。図６ｂ、ｃでは、いくつかの細胞が視野から出ているためである。これら 4 つのイベントの増加率は \(0.77\pm 0.1\) h-1 です。この値は、細胞が正常に増殖する図 3.3 および 4 に関連する増殖速度よりも高くなります。胞子からの G. stearothermophilus の増殖速度の増加の理由は不明ですが、これらの測定は LA-HTM の興味深い点を強調しており、細胞寿命の動態についてさらに知るために単一細胞レベル (または単一 mCFU レベル) で機能することを示しています。 。
LA-HTM の多用途性と高温での性能をさらに実証するために、最適生育温度 80°C の超好熱性好酸性古細菌である Sulfolobus shibatae の生育を調べました 51。 G. stearothermophilus と比較すると、これらの古細菌も非常に異なる形態を持ち、細長い桿菌 (桿菌) ではなく 1 ミクロンの球 (球菌) に似ています。
図 7a は、CGM を使用して取得された S. shibatae mCFU の連続光学深度画像で構成されています (補足資料の M7 フィーチャー フィルムを参照)。この mCFU は約 73°C で増殖し、最適温度である 80°C を下回りますが、活発に増殖する温度範囲内にあります。数時間後には、mCFU が古細菌の微ブドウのように見える複数の分裂現象が観察されました。これらの OT 画像から、mCFU バイオマスが経時的に測定され、図 7b に示されています。興味深いことに、S. shibatae mCFU は、G. stearothermophilus mCFU で見られる指数関数的な増殖ではなく、直線的な増殖を示しました。細胞増殖速度の性質については長年の議論がなされてきました 52。いくつかの研究では微生物の増殖速度がそのサイズに比例する (指数関数的増殖) と報告されていますが、他の研究は一定の速度 (線形または双線形増殖) を示します。 Tzur et al.53 が説明しているように、指数関数的成長と（双）線形成長を区別するには、バイオマス測定の精度が 6% 未満である必要がありますが、これは干渉計を含むほとんどの QPM 技術では不可能です。 Tzur et al.53 が説明しているように、指数関数的成長と（双）線形成長を区別するには、バイオマス測定の精度が 6% 未満である必要がありますが、これは干渉計を含むほとんどの QPM 技術では不可能です。 Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в измерениях QPM は、最高のパフォーマンスを提供します。 Zur et al.53 が説明しているように、指数関数的成長と（双）線形成長を区別するには、バイオマス測定の精度が 6% 未満である必要がありますが、これは干渉計を使用した場合でも、ほとんどの QPM 方法では達成できません。Zurらによって説明されているように。 53 に示されているように、指数関数的成長と (双) 線形成長を区別するには、バイオマス測定の精度が 6% 未満である必要がありますが、これは、干渉計が使用されている場合でも、ほとんどの QPM 方法では達成できません。 CGM は、バイオマス測定において pg 未満の精度でこの精度を達成します 36,48。
a 6 枚の OT 画像（油浸、60 倍、NA 対物レンズ 1.25）からなるタイムラプス画像と、（b）CGM で測定されたマイクロ CFU バイオマスの進化。詳細については、映画 M7 を参照してください。
S. shibatae の完全に直線的な成長は予想外であり、まだ報告されていません。ただし、少なくとも時間の経過とともに 2、4、8、16 個などの複数の細胞分裂が発生する必要があるため、指数関数的な増殖が予想されます。私たちは、細胞密度が高すぎると細胞の成長が遅くなり、最終的には休止状態に達するのと同様に、直線的な成長は高密度の細胞の充填による細胞の阻害によるものである可能性があると仮説を立てました。
最後に、加熱量の減少、熱慣性の減少、金ナノ粒子への関心、定量的位相顕微鏡への関心、LA-HTM が使用できる可能な温度範囲という 5 つの興味深い点について順番に説明します。
抵抗加熱と比較して、HTM 開発に使用されるレーザー加熱にはいくつかの利点があり、それをこの研究で説明します。特に、顕微鏡の視野内の液体媒体では、加熱体積は数 (10 μm) 3 体積以内に保たれます。このようにして、観察された微生物だけが活動し、他のバクテリアは休眠状態になり、サンプルをさらに研究するために使用できます。新しい温度をチェックする必要があるたびにサンプルを変更する必要はありません。さらに、マイクロスケール加熱により、広範囲の温度を直接検査することができます。図 4c は 3 時間の映画 (映画 M3) から得られたものですが、通常、複数のサンプル (研究対象のサンプルごとに 1 つ) の準備と検査が必要です。 y は実験の日数を表す温度です。加熱体積を減らすと、顕微鏡の周囲のすべての光学部品、特に対物レンズも室温に保たれますが、これはこれまでコミュニティが直面している大きな問題でした。 LA-HTM は油浸レンズを含むあらゆるレンズで使用でき、視野内の温度が極端に高くても室温に保ちます。この研究で報告するレーザー加熱法の主な制限は、接着または浮遊していない細胞は視野から遠く離れており、研究が難しい可能性があることです。回避策としては、低倍率レンズを使用して、数百ミクロンを超える大きな温度上昇を達成することが考えられます。この注意には空間分解能の低下が伴いますが、微生物の動きを研究することが目的であれば、高い空間分解能は必要ありません。
システムの加熱 (および冷却) にかかる時間スケール \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) はそのサイズによって異なります。法則によると \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\)、ここで \ (L\ ) は熱源の特徴的なサイズ (私たちの研究におけるレーザービームの直径は \(L\ 約 100\) μm)、\(D\) は環境の熱拡散率 (私たちの研究での平均)したがって、この研究では、時間応答は 50 ミリ秒程度、つまり準瞬間的です。この瞬間的な温度上昇の確立により、実験時間が短縮されるだけでなく、温度の影響を動的に研究するための正確なタイミング \(t=0\) が可能になります。
私たちが提案する方法は、あらゆる光吸収基板（たとえば、ITO コーティングを施した市販のサンプル）に適用できます。しかし、金ナノ粒子は赤外域での高い吸収と可視域での低吸収を提供することができ、後者の特性は可視域での効果的な光学観察、特に蛍光を使用する場合に興味深いものです。さらに、金は生体適合性があり、化学的に不活性で、光学密度は 530 nm から近赤外まで調整でき、サンプルの調製は簡単で経済的です 29。
横格子波面顕微鏡 (CGM) は、マイクロスケールでの温度マッピングだけでなく、バイオマスのモニタリングも可能にするため、LA-HTM と組み合わせると (必要でない場合) 特に役立ちます。過去 10 年間に、特にバイオイメージングの分野で他の温度顕微鏡技術が開発されてきましたが、そのほとんどは温度感受性蛍光プローブの使用を必要とします 54,55。しかし、これらの方法は批判されており、おそらく蛍光が温度以外の多くの要因に依存するため、細胞内の非現実的な温度変化を測定した報告もあります。さらに、ほとんどの蛍光プローブは高温では不安定になります。したがって、QPM、特に CGM は、光学顕微鏡を使用して高温での生命を研究するための理想的な温度顕微鏡技術となります。
80℃で最適に生存する S. shibatae の研究では、LA-HTM が単純な好熱菌だけでなく超好熱菌の研究にも適用できることが示されています。原則として、LA-HTM を使用して到達できる温度範囲に制限はなく、大気圧での水熱化学アプリケーションの 38 人のグループが実証したように、大気圧では 100°C を超える温度でも沸騰することなく到達できます。同様に金ナノ粒子４０を加熱するためにレーザーが使用される。したがって、LA-HTM は、標準条件下 (つまり、環境ストレス下) で標準の高解像度光学顕微鏡を使用して、前例のない超好熱菌を観察するために使用できる可能性があります。
すべての実験は、ケーラー照明 (LED、M625L3、Thorlabs、700 mW 付き)、手動 xy 移動付き標本ホルダー、対物レンズ (Olympus、60x、0.7 NA、空気、LUCPlanFLN60X または 60x、1.25 NA、油) を含む自家製顕微鏡を使用して実行されました。 、UPLFLN60XOI）、強度と波面イメージングを提供する CGM カメラ（QLSI クロスグレーティング、39 μm ピッチ、Andor Zyla カメラ センサーから 0.87 mm）、および sCMOS カメラ（ORCA Flash 4.0 V3、16 ビット モード、浜松ホトニクス製）データを図 5 に示します (細菌の遊泳)。ダイクロイック ビーム スプリッターは 749 nm BrightLine エッジ (Semrock、FF749-SDi01) です。カメラ前面のフィルターは 694 ショートパスフィルター (FF02-694/SP-25、Semrock) です。チタン サファイア レーザー (Laser Verdi G10、532 nm、10 W、励起津波レーザー キャビティ、図 2-5 の Spectra-Physics、図 2 ではさらに Millenia レーザー、Spectraphysics 10 W、励起 Mira レーザー キャビティ、Coherent に置き換えられました) -5)。図 6 および 7) は、金ナノ粒子のプラズモン共鳴スペクトルに相当する波長 \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm に設定されています。空間光変調器 (1920 × 1152 ピクセル）は、Meadowlark Optics から購入しました。リンク 39 で説明されているように、Gerchberg-Saxton アルゴリズムを使用して計算されました。
クロスグレーティング波面顕微鏡 (CGM) は、従来のカメラのセンサーから 1 ミリメートルの距離にある 2 次元回折格子 (クロスグレーティングとも呼ばれる) の組み合わせに基づいた光学顕微鏡技術です。この研究で使用した CGM の最も一般的な例は、4 波長横シフト干渉計 (QLSI) と呼ばれるもので、クロス グレーティングは、Primot らが導入し特許を取得した強度/位相チェッカーボード パターンで構成されています。垂直および水平の格子線はセンサー上に格子状の影を作成し、その歪みをリアルタイムで数値処理して、入射光の光学波面歪み (または同等の位相プロファイル) を取得できます。 CGM カメラを顕微鏡で使用すると、光学深度 (OT) とも呼ばれる、撮像された物体の光路差をナノメートルオーダーの感度で表示できます36。 CGM 測定では、光学コンポーネントまたはビームの欠陥を除去するために、一次基準 OT 画像を取得し、後続の画像から差し引く必要があります。
参考文献に記載されているように、温度顕微鏡検査は CGM カメラを使用して実行されました。 32. つまり、液体を加熱するとその屈折率が変化し、入射ビームを歪ませる熱レンズ効果が生じます。この波面の歪みは CGM によって測定され、デコンボリューション アルゴリズムを使用して処理され、液体媒体内の 3 次元の温度分布が取得されます。金ナノ粒子がサンプル全体に均一に分布している場合、バクテリアのない領域で温度マッピングを実行してより良い画像を生成できます。これは私たちが時々行うことです。参照 CGM 画像は、加熱せずに (レーザーをオフにして) 取得され、その後、レーザーをオンにして画像内の同じ位置でキャプチャされました。
乾燥質量の測定は、温度イメージングに使用されるのと同じ CGM カメラを使用して行われます。 CGM 参照画像は、バクテリアの存在による OT の不均一性を平均する手段として、露光中にサンプルを x および y 方向に急速に移動させることによって取得されました。細菌の OT 画像から、参考文献に記載されている手順に従って、Matlab の自家製セグメンテーション アルゴリズム (サブセクション「数値コード」を参照) を使用して選択された領域にわたる画像のアンサンブルを使用して、細菌のバイオマスが取得されました。 48. つまり、関係 \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} を使用します} x{{\mbox{d}}}y\)、\({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) は光学深度画像、\(m\) は乾燥重量であり、\({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) は定数です。 \({{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg を選択しました。これは、生細胞の一般的な定数です。
金ナノ粒子でコーティングされた直径25 mm、厚さ150 μmのカバースリップを、金ナノ粒子を上にしてAttofluorTMチャンバー(Thermofisher)内に配置した。 Geobacillus stearothermophilus は、毎日の実験の前に LB 培地 (200 rpm、60℃) で一晩前培養されました。光学密度 (OD) 0.3 ～ 0.5 の G. stearothermophilus の懸濁液 5 μl を、金ナノ粒子を含むカバー スリップ上に置きました。次いで、中心に直径５ｍｍの穴を有する直径１８ｍｍの丸いカバースリップを液滴上に滴下し、同じ光学濃度を有する細菌懸濁液５μｌを穴の中心に繰り返し塗布した。カバースリップ上のウェルは、参考文献に記載されている手順に従って準備されました。 45 (詳細については補足情報を参照)。次に、液体層の乾燥を防ぐために、カバースリップに LB 培地 1 ml を追加します。最後のカバーガラスは、インキュベーション中の培地の蒸発を防ぐために、Attofluor™ チャンバーの閉じた蓋の上に置かれます。発芽実験には胞子を使用しましたが、従来の実験の後、胞子が上部のカバーガラスを覆うことがありました。同様の方法を使用して Sulfolobus shibatae を取得しました。チオバチルス・セラータを培地１８２（ＤＳＭＺ）で３日間（２００ｒｐｍ、７５℃）予備培養した。
金ナノ粒子のサンプルは、ミセルブロック共重合体リソグラフィーによって調製されました。このプロセスについては、第 4 章で詳しく説明します。 60. 簡単に言うと、金イオンを封入したミセルは、共重合体をトルエン中でHAuCl4と混合することによって合成された。次に、洗浄したカバースリップを溶液に浸漬し、還元剤の存在下で UV 照射で処理して金シードを得ました。最後に、カバースリップを KAuCl4 およびエタノールアミンの水溶液と 16 分間接触させることによって金シードを成長させ、その結果、近赤外領域で非球形の金ナノ粒子が準周期的かつ非常に均一に配置されました。
インターフェログラムを OT 画像に変換するには、リンクで詳しく説明されているように、自家製のアルゴリズムを使用しました。 33 に準拠しており、パブリック リポジトリ https://github.com/baffou/CGMprocess で Matlab パッケージとして入手できます。このパッケージは、記録されたインターフェログラム (参照画像を含む) とカメラ アレイの距離に基づいて強度と OT 画像を計算できます。
特定の温度プロファイルを取得するために SLM に適用される位相パターンを計算するために、以前に開発された自家製アルゴリズム 39,42 を使用しました。このアルゴリズムは、次のパブリック リポジトリで入手可能です: https://github.com/baffou/SLM_tempertureShaping。入力は希望の温度フィールドで、デジタルまたはモノクロ BMP 画像経由で設定できます。
細胞を分割して乾燥重量を測定するために、パブリック リポジトリ https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation で公開されている Matlab アルゴリズムを使用しました。各画像上で、ユーザーは対象の細菌または mCFU をクリックし、ワンドの感度を調整し、選択を確認する必要があります。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの要約を参照してください。
この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて各著者から入手できます。
この研究で使用されるソース コードについては、「メソッド」セクションで詳しく説明されています。デバッグ バージョンは、リポジトリの https://github.com/baffou/ からダウンロードできます: SLM_tempertureShaping、CGMprocess、および CGM_magicWandSegmentation。
Mehta, R.、Singhal, P.、Singh, H.、Damle, D. & Sharma, AK 好熱菌とその幅広い用途に関する洞察。 Mehta, R.、Singhal, P.、Singh, H.、Damle, D. & Sharma, AK 好熱菌とその幅広い用途に関する洞察。Mehta, R.、Singhal, P.、Singh, H.、Damle, D.、Sharma, AK 好熱菌とその広範な応用の概要。 Mehta, R.、Singhal, P.、Singh, H.、Damle, D.、Sharma, AK は、好熱菌とその応用について深く理解しています。 Mehta、R.、Singhal、P.、Singh、H.、Damle、D.、Sharma、AK。Mehta R.、Singhal P.、Singh H.、Damle D.、Sharma AK 好熱菌と幅広い応用についての深い理解。3 バイオテクノロジー 6、81 (2016)。
投稿日時: 2022 年 9 月 26 日